2025年3月28日 ，阿法納生物與中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)王育才教授團(tuán)隊(duì)合作，《Nature Biomedical Engineering》上發(fā)表題為" Generation of tolerogenic antigen-presenting cells in vivo via the delivery of mRNA encoding PDL1 within lipid nanoparticles "的研究論文。
研究先是以Moderna COVID-19 mRNA疫苗的LNP配方為參考，根據(jù)田口正交陣列設(shè)計(jì)創(chuàng)建9種LNP配方，通過(guò)艾特森MPE-L2型微流控設(shè)備儀完成樣品制備，為后續(xù)小鼠皮下給藥、不同配方免疫原性評(píng)估及低免疫原性配方篩選提供了精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)制備支撐，是實(shí)現(xiàn)低免疫原性LNPs配方優(yōu)化與驗(yàn)證的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。
研究背景
文獻(xiàn)中創(chuàng)新性地構(gòu)建了低免疫原性脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)遞送PD-L1 mRNA，在體內(nèi)直接編程生成耐受性抗原呈遞細(xì)胞(tol-APCs)，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫病模型中展現(xiàn)出療效，實(shí)現(xiàn)無(wú)需體外細(xì)胞操作、直接在體內(nèi)構(gòu)建功能性tol-APCs的治療策略。該策略不僅能選擇性抑制致病性T細(xì)胞活化，還能擴(kuò)大調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)群體，真正實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)抑制病灶、重建免疫耐受”的自免治療新機(jī)制，具有很強(qiáng)的疾病特異性和長(zhǎng)期療效潛力。
1. 核心概念與機(jī)制框架
針對(duì)傳統(tǒng)tol-APCs 體外制備的復(fù)雜性，研究團(tuán)隊(duì)提出 “低免疫原性mRNA遞送+體內(nèi)原位生成tol-APCs”的核心策略，同時(shí)明確其治療機(jī)制：tol-APCs通過(guò)PDL1/PD1通路，選擇性靶向高表達(dá)PD1的激活T細(xì)胞(誘導(dǎo)其凋亡、抑制其增殖)，并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)擴(kuò)增，且不影響低表達(dá)PD1的初始T細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)奠定明確方向。
圖例1：核心概念與機(jī)制框架
2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
? 通過(guò) Design of Experiments 選擇低免疫原性的LNPs
圖例2：配方篩選
通過(guò)艾特森MPE-L2微流控設(shè)備制備樣品后，對(duì)小鼠皮下給藥，評(píng)估不同配方的免疫原性，結(jié)果中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)組成(摩爾比)和N/P比均對(duì)LNPs的轉(zhuǎn)染效率和免疫原性有顯著影響，在9組中選取低免疫原性的配方，以避免在AIDs治療中引發(fā)意外的免疫反應(yīng)。
? 低免疫原性LNPs/mPDL1制備工藝條件
圖例3：LNPs/mPDL1制備過(guò)程
? 制備包載PDL1 mRNA的LNPs
3. 低免疫原性LNPs的篩選優(yōu)化
基于圖例1對(duì)載體的低免疫原性需求，圖例4通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)完成載體篩選，以EGFP mRNA為報(bào)告基因，檢測(cè)淋巴結(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)的共刺激分子(CD80、CD86、CD40)表達(dá)，最終篩選出A7配方(SM-102:DSPC:DMG-PEG2000: 膽固醇=25:5:0.5:69.5，N/P=4)，其共刺激分子表達(dá)最低，為mRNA遞送提供理想載體。
圖例4：低免疫原性LNPs的篩選優(yōu)化
4.LNPs/mPDL1體內(nèi)外生成tol-APCs
載體優(yōu)化后，研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證核心功能：體外實(shí)驗(yàn)中，DC2.4和RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LNPs/mPDL1處理后，表面 PDL1表達(dá)顯著升高；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，小鼠皮下注射LNPs/mPDL1 后，淋巴結(jié)、脾臟、外周血中的CD11c +和 CD11b+ APC 高表達(dá)PD1，骨髓中無(wú)tol-APCs 生成，且 tol-APCs可持續(xù)存在至少4天，該方法僅靶向APC，對(duì)非APC免疫細(xì)胞影響極小。
圖例5：LNPs/mPDL1體內(nèi)外生成tol-APCs
5.tol-APCs對(duì)激活T細(xì)胞的體外調(diào)控
為驗(yàn)證tol-APCs的調(diào)控功能，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)：激活的T細(xì)胞高表達(dá)PD1，與LNPs/mPDL1誘導(dǎo)的tol-APCs共培養(yǎng)后，CD4+和 CD8+T細(xì)胞增殖顯著受抑，且tol-APCs可誘導(dǎo)激活T細(xì)胞凋亡，不影響初始T細(xì)胞，激活T細(xì)胞caspase-3/7活性增強(qiáng)，佐證凋亡通路參與調(diào)控。
圖例6：tol-APCs對(duì)激活T細(xì)胞的體外調(diào)控
6.tol-APCs對(duì)激活T細(xì)胞的體內(nèi)選擇性清除
體外機(jī)制明確后，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證體內(nèi)效果：用CFSE標(biāo)記區(qū)分激活T 細(xì)胞(高CFSE)和初始T細(xì)胞(低CFSE)，輸注給預(yù)先注射LNPs/mPDL1的裸鼠，結(jié)果顯示LNPs/mPDL1處理組中，激活T細(xì)胞占比、激活/初始T細(xì)胞比值顯著降低，CD4+和CD8+激活T細(xì)胞被選擇性清除，初始T細(xì)胞比例升高，驗(yàn)證了治療的安全性和特異性。
圖例7：tol-APCs對(duì)激活T細(xì)胞的體內(nèi)選擇性清除
7.RA模型中tol-APCs的治療效果
機(jī)制驗(yàn)證完成后，研究團(tuán)隊(duì)將策略應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)模型：DBA/1小鼠經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫誘導(dǎo)RA，給予LNPs/mPDL1、空LNPs、依那西普(臨床RA治療藥物)或PBS處理，結(jié)果顯示LNPs/mPDL1組關(guān)節(jié)炎指數(shù)、爪墊腫脹程度顯著降低，關(guān)節(jié)軟骨損傷減輕，炎癥因子(IFN-γ、TNF-α)水平降低，淋巴結(jié)中促炎CD4+T細(xì)胞減少、Treg細(xì)胞增多，療效與依那西普相當(dāng)。
圖例8：RA模型中tol-APCs的治療效果
8.UC模型中tol-APCs的治療效果
為證明策略普適性，研究團(tuán)隊(duì)將其拓展至潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型：C57BL/6小鼠飲用3%DSS水溶液誘導(dǎo)UC，給予LNPs/mPDL1、空LNPs、環(huán)孢素(臨床UC治療藥物)或PBS處理，結(jié)果顯示 LNPs/mPDL1組疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)降低，體重下降和結(jié)腸縮短現(xiàn)象改善，腸道黏膜損傷減輕，腸系膜淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞減少、Treg細(xì)胞增多，療效與環(huán)孢素相當(dāng)。
圖例9：UC模型中tol-APCs的治療效果
知識(shí)分享：研究亮點(diǎn)
1 低免疫原性脂質(zhì)納米粒(LNPs)設(shè)計(jì)：通過(guò)優(yōu)化脂質(zhì)成分及氮磷比(N/P)，開(kāi)發(fā)出低免疫原性的LNPs/mPDL1遞送系統(tǒng)，顯著減少APC表面共刺激分子(如CD80、CD86、CD40)的表達(dá)，避免傳統(tǒng)LNPs的佐劑效應(yīng)，從而抑制非特異性免疫激活；
2 體內(nèi)原位生成致耐受性APCs：利用mRNA技術(shù)，通過(guò)皮下注射LNPs/mPDL1，直接在體內(nèi)誘導(dǎo)APCs高表達(dá)PDL1，生成tol-APCs，選擇性靶向活化的PD1和 T細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)保留初始T細(xì)胞；
3 廣譜治療潛力與臨床轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)：在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)小鼠模型中，LNPs/mPDL1顯著緩解炎癥、減少致病性Th1/Th17細(xì)胞、增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，療效媲美臨床藥物(如依那西普、環(huán)孢素)，為自身免疫病及器官移植耐受提供了新策略。
參考文獻(xiàn)：
Nature Biomedical Engineering ( IF 26.8 ) Pub Date:2025-03-28，DOI: 10.1038/s41551-025-01373-0.
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