2025年1月30日 ，醫(yī)藥先進(jìn)制造國家工程研究中心何軍團(tuán)隊(duì)在《Nano Today》上發(fā)表了題為" Designed microchannel-based lipid nanoparticles encapsulated siRNA targeting gasdermin D for sepsis management via pulmonary delivery "的學(xué)術(shù)論文。
研究團(tuán)隊(duì)自主設(shè)計(jì)的 “CA/SAR型集成芯片”(CA/SAR/C1)，通過艾特森微流控制備儀MPE-L2實(shí)現(xiàn)了制備靶向Gasdermin D(GSDMD)的siRNA脂質(zhì)納米顆粒(siGSDMD-LNPs)的連續(xù)、可控、高效制備，該納米粒在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中展現(xiàn)出顯著的治療效果，為探索膿毒癥治療新策略提供了重要參考。
研究背景
膿毒癥是一種由感染引發(fā)的失控性宿主反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致致命性器官功能障礙。該病死亡率高達(dá)40%，目前缺乏獲批的有效治療藥物。
Gasdermin D(GSDMD)屬Gasdermin蛋白家族，抑制GSDMD可阻斷炎癥細(xì)胞焦亡、減輕膿毒癥癥狀；小干擾RNA(siRNA)具有靶向特異性強(qiáng)、沉默效率高的優(yōu)勢；脂質(zhì)納米粒(LNPs)是siRNA的理想非病毒遞送載體。
1. siGSDMD-LNPs的制備流程及膿毒癥緩解機(jī)制示意圖
研究團(tuán)隊(duì)清晰展示基于CA/SAR/C1微通道的siGSDMD-LNPs制備工藝，明確了脂質(zhì)組分、緩沖體系以及微流控混合稀釋的完整流程。
而該納米粒緩解膿毒癥的機(jī)制在于：siGSDMD經(jīng)LNPs遞送后，能夠沉默GSDMD基因，抑制GSDMD蛋白的切割以及膜孔形成，進(jìn)而阻斷細(xì)胞焦亡、炎癥因子釋放和器官損傷，最終達(dá)到緩解膿毒癥的效果。
圖例1：siGSDMD-LNPs的制備流程及膿毒癥緩解機(jī)制示意圖
2. 制備過程
圖例2：siGSDMD-LNPs制備過程
3. CA/SAR微通道和CA/SAR/C1生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的LNP的擴(kuò)展策略
展示從微通道設(shè)計(jì)到LNPs連續(xù)生產(chǎn)的技術(shù)路徑，整合圓形不對(duì)稱分裂-重組混合原理，通過多入口協(xié)同進(jìn)料實(shí)現(xiàn)流體精準(zhǔn)調(diào)控，解決傳統(tǒng)工藝通量低、一致性差的問題，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量均一LNPs的規(guī)模化制備。
圖例3：CA/SAR微通道和CA/SAR/C1生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的LNP的擴(kuò)展策略
4.候選圓形SAR微通道結(jié)構(gòu)及混合行為模擬圖
研究團(tuán)隊(duì)呈現(xiàn)三種主副通道寬度比(1:1、2:1、3:1)的微通道構(gòu)型(Type A/B/C)，模擬不同雷諾數(shù)下的流體混合狀態(tài)，并展示CA/SAR/C1芯片的內(nèi)部通道結(jié)構(gòu)，為篩選高效混合微通道提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。
圖例4：候選圓形SAR微通道結(jié)構(gòu)及混合行為模擬圖
5.微通道網(wǎng)格獨(dú)立性驗(yàn)證及混合效率分析圖
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過驗(yàn)證不同網(wǎng)格精度下通道截面的濃度和流速分布，確定最優(yōu)計(jì)算網(wǎng)格；對(duì)比三種微通道的混合指數(shù)、壓力降和混合成本效率，明確Type C的混合成本效率最低，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論支撐。
圖例5：微通道網(wǎng)格獨(dú)立性驗(yàn)證及混合效率分析圖
6.三種微通道在不同循環(huán)次數(shù)的混合性能對(duì)比圖
對(duì)比Type A/B/C在不同雷諾數(shù)、不同循環(huán)次數(shù)下的混合效果，證實(shí)CA/SAR結(jié)構(gòu)的Type B/C混合效率優(yōu)于CS/SAR結(jié)構(gòu)的Type A，其中Type C在雷諾數(shù)大于100時(shí)僅需3個(gè)循環(huán)即可實(shí)現(xiàn)完全混合。
圖例6：三種微通道在不同循環(huán)次數(shù)的混合性能對(duì)比圖
7.Type C微通道模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證及LNPs形態(tài)對(duì)比圖
在前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)比Type C微通道內(nèi)乙醇-水兩相混合的模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證模擬參數(shù)準(zhǔn)確性；通過觀察siGSDMD-LNPs制備過程中的混合狀態(tài)，對(duì)比Type C、SHM、TrM制備的LNPs粒徑和形態(tài)，證實(shí)Type C制備的LNPs粒徑更小、均一性更好。
圖例7：Type C微通道模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證及LNPs形態(tài)對(duì)比圖
8.siRNA序列篩選及siGSDMD-LNPs理化性質(zhì)與穩(wěn)定性表征圖
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步篩選出沉默效率最高的siGSDMD#3序列；通過表征siGSDMD-LNPs的粒徑、電位和形態(tài)，驗(yàn)證其在PBS、血清、血漿中的稀釋穩(wěn)定性及4℃儲(chǔ)存9個(gè)月的長期穩(wěn)定性，確定性能穩(wěn)定的siGSDMD-LNPs制備方案。
圖例8：siRNA序列篩選及siGSDMD-LNPs理化性質(zhì)與穩(wěn)定性表征圖
9.siGSDMD-LNPs在BMDMs中的細(xì)胞攝取與溶酶體逃逸驗(yàn)證圖
在確定siGSDMD-LNPs制備方案后，研究團(tuán)隊(duì)為驗(yàn)證該納米粒的體內(nèi)作用機(jī)制，通過檢測不同時(shí)間點(diǎn)LNPs在骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDMs)內(nèi)的攝取效率，驗(yàn)證出LNPs對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響的結(jié)論；觀察到siRNA在6小時(shí)可從溶酶體釋放至細(xì)胞質(zhì)，證實(shí)LNPs具備高效細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸能力。
圖例9：siGSDMD-LNPs在BMDMs中的細(xì)胞攝取與溶酶體逃逸驗(yàn)證圖
10.siGSDMD-LNPs在BMDMs中抑制GSDMD表達(dá)及炎癥因子分泌的驗(yàn)證圖
在經(jīng)典/非經(jīng)典焦亡模型中，檢測到LNPs可顯著抑制GSDMD及GSDMD-N蛋白表達(dá)，下調(diào)炎癥因子的mRNA水平和分泌量，在細(xì)胞層面證實(shí)其靶向沉默 GSDMD、抑制炎癥反應(yīng)的效果。
圖例10：siGSDMD-LNPs在BMDMs中抑制GSDMD表達(dá)及炎癥因子分泌的驗(yàn)證圖
11.siGSDMD-LNPs 經(jīng)肺部遞送后的體內(nèi)組織分布驗(yàn)證圖
進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊(duì)通過活體和離體器官成像，發(fā)現(xiàn)LNPs經(jīng)肺部遞送后主要富集于肺組織，且滯留時(shí)間長于游離siRNA，明確其肺部靶向遞送特征。
圖例11：siGSDMD-LNPs 經(jīng)肺部遞送后的體內(nèi)組織分布驗(yàn)證圖
12.siGSDMD-LNPs 緩解膿毒癥小鼠肺部炎癥及提高生存率的驗(yàn)證圖
研究團(tuán)隊(duì)通過設(shè)計(jì)小鼠體內(nèi)給藥的實(shí)驗(yàn)方案，檢測到膿毒癥小鼠血漿炎癥因子水平降低，肺組織GSDMD表達(dá)及炎癥因子mRNA水平下調(diào)，肺組織病理損傷減輕；生存曲線證實(shí)siGSDMD-LNPs可顯著提高膿毒癥小鼠的生存率。
圖例12：siGSDMD-LNPs 緩解膿毒癥小鼠肺部炎癥及提高生存率的驗(yàn)證圖
13.siGSDMD-LNPs 緩解膿毒癥小鼠肝腎損傷的驗(yàn)證圖
研究團(tuán)隊(duì)檢測到給予siGSDMD-LNPs后的膿毒癥小鼠中肝腎組織中的GSDMD表達(dá)及炎癥因子水平降低，肝腎組織病理損傷減輕，證實(shí)siGSDMD-LNPs對(duì)膿毒癥所致多器官損傷具有保護(hù)作用。
圖例13：siGSDMD-LNPs緩解膿毒癥小鼠肝腎損傷的驗(yàn)證圖
知識(shí)分享：研究亮點(diǎn)
本研究通過優(yōu)化微流控芯片設(shè)計(jì)制備出性能優(yōu)異的siGSDMD-LNPs，經(jīng)肺部遞送后可靶向沉默的GSDMD，阻斷焦亡通路，減輕膿毒癥引發(fā)的多器官損傷，為膿毒癥治療提供了新策略。
參考文獻(xiàn)：
Nano Today ( IF 13.2 ) Pub Date:2025-01-30,DOI: 10.1016/j.nantod.2025.102653.
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